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骨关节炎软骨细胞外基质破坏中机械应力-生物信号-效应分子通路的进一步探索

批准号81273298 学科分类自身免疫性疾病 ( H1008 )
项目负责人管剑龙 负责人职称主任医师 依托单位复旦大学
资助金额60.00
万元
项目类别面上项目 研究期限2013 年 01 月 01 日 至
2016 年 12 月 31 日
中文主题词骨关节炎;软骨细胞;细胞外基质;降解;信号通路
英文主题词Osteoarthritis;Chondrocytes;Extracellular matrix;Degradation;Signal pathway

摘要

中文摘要 骨关节炎(OA)是一种老年人最常见的关节疾病,以关节软骨进行性破坏为特征。我们前期工作中,成功建立了软骨细胞/琼脂糖三维培养施压模型,探索出软骨细胞106cells/mL、琼脂糖2.5%的最佳浓度,30kPa、0.33Hz施压参数,以及施压时间15min、30min、60min和120min。结果显示,机械压力显著增加软骨细胞MCP-1表达、减少MMP-1表达,维拉帕米则同时减少MCP-1和MMP-1表达;对MMP-3、-13无显著影响。文献报告,蛋白聚糖酶-1和-2在关节软骨破坏中起更重要的作用,与MMPs比较大约提前3周。因此,本研究下一步工作,采用该模型通过Flexcell 4000施压,采用实时定量RT-PCR、ELISA、免疫组化、免疫印迹等方法重点探讨MCP-1和蛋白聚糖酶表达机制、钙离子通道和CD44藕合分子的存在,以及该模型中软骨细胞周围Ⅱ型胶原和蛋白聚糖合成。
英文摘要 Osteoarthritis (OA) is an most common joint disease elderly with the characterized articular cartilage deg-radation. Our previous work successfully established the chondrocyte/agarose solid three-dimensional cul-ture model for mechanical load and find the optimal concentration of chondrocytes 106cells/mL, agarose 2.5%, and best pressure conditions 30kPa, 0.33Hz for 15min, 30min, 60min and 120min. The results show the mechanical stress significantly increased chondrocytes expressing MCP-1, reduced the expression of MMP-1, verapamil decreased both MCP-1 and MMP-1 expressions; but no significant effect on MMP-3, -13. The literature reported the aggrecanases play a more important role in the destruction of the articular cartilage, and about three weeks earlier compared with MMPs. The inhibition of aggrecanase-1, -2 can ef-fectively prevent the damage of articular cartilage. Therefore, the next step of our works, This model will be loaded using Flexcell 4000 pressure, and the real-time quantitative RT-PCR, ELISA, immunestaining and western blot are applied to focus on the mechanism for the increase in MCP-1 andaggrecanases,the presence of coupled calcium channels/CD44 molecular and and the synthesis of collagen type Ⅱ and proteoglycans pericellular matix of the model.
结题摘要 骨关节炎(Osteoarthritis, OA)是中老年人最常见的骨关节病,随着人口老龄化日益加重,OA所致的长期、慢性关节疼痛,给老年人日常生活带来了极大的困扰。除磨损造成的软骨直接损伤外,软骨细胞外基质合成与分解失衡是OA发病机制之一。本研究采用Flexcell FX-5000TM细胞加力仪对骨关节炎软骨细胞-琼脂糖模型施压,以及维拉帕米干预,研究机械应力和维拉帕米对软骨细胞蛋白聚糖和Ⅱ型胶原代谢的影响,为OA治疗方法的研究提供新思路。入选行关节置换术的膝OA患者,取胫骨平台软骨,分离软骨细胞,制作软骨细胞-琼脂糖三维模型。采用Flexcell FX-5000TM细胞加力仪施压,维拉帕米干预浓度设定40μmol/L。采用RT-PCR和Western Blot法检测软骨细胞-琼脂糖三维模型蛋白聚糖、ADAMTS-4, ADAMTS-5, CollagenⅡ, MMP-1, MMP-3和MMP-13 mRNA和蛋白水平,ELISA法检测上清液中上述蛋白的水平。结果:1.适当的机械应力可促进OA软骨细胞/琼脂糖AGC合成代谢,抑制ADAMTS-5生成,且在一定的压力变化范围内(0kPa-24kPa),随着压力增加,AGC生成增加,ADAMTS-5生成减少。2.机械应力(0kPa-24kPa)对OA软骨细胞/琼脂糖ADAMTS-4的表达无影响。3.维拉帕米(40μmol/L)单独或者与机械应力联合均可促进软骨细胞AGC合成,抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5生成。4.机械应力(24kPa)可促进软骨细胞CollagenⅡ合成,抑制MMP-1和MMP-13生成,MMP-3变化趋势不明显。5.维拉帕米(40μmol/L)可抑制MMP-1, MMP-3和MMP-13生成,促进软骨细胞CollagenⅡ合成,联合机械应力可进一步加强促CollagenⅡ合成作用。

成果

序号 标题 类型 作者

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